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Devido ao princípio do teste, o teste G requer um alto padrão de tubos de coleta de sangue, que sejam não apenas estéreis, mas também livres de pirogênios e enzimas.

Motivos de falha dos tubos de coleta de sangue

(1) Contaminação bacteriana ou fúngica ou a presença de pirogênios (ou seja, endotoxinas);

(2) Interferência de certos íons ou de outros componentes do procoagulante.

O tempo ideal desde a coleta do espécime até o teste é de no máximo 2 horas, e as amostras podem ser armazenadas em temperatura ambiente por até 6 horas após a separação do soro.

As amostras de soro devem ser mantidas refrigeradas a 2-8°C por no máximo 24 horas. Para armazenamento de longo prazo, a temperatura deve ser inferior a -20°C, preferencialmente -70°C. Evite congelar e descongelar as amostras repetidamente. O transporte refrigerado é obrigatório. Para usuários que realizam 1-2 sessões por semana, as amostras de soro devem ser transferidas para frascos de transferência apirógenos ou tubos EP apirógenos para armazenamento. Amostras não centrifugadas não devem ser armazenadas. O soro não deve ser congelado e descongelado repetidamente, pois isso altera o material do soro, especialmente as proteínas, e afeta os resultados dos testes.

Os componentes do kit de teste G, após abertura e dissolução à temperatura ambiente, o excesso de reagente principal deve ser rotulado e congelado imediatamente, e o reagente principal não congelado deve ser utilizado em até 15 minutos; os padrões e produtos de controle de qualidade não devem permanecer por mais de 1 hora após a redissolução. (Na prática, observa-se que quanto menor o tempo em que o reagente principal permanece à temperatura ambiente, mais favorável é para sua estabilidade de conservação.)

Se os valores de taxa do padrão, CQ e amostra estiverem todos baixos, isso pode ser devido à falha do reagente principal ou à baixa temperatura do marcador enzimático; se apenas os valores de taxa do CQ e da amostra estiverem baixos, isso pode ser devido à mistura irregular da solução de tratamento. As instruções do teste G exigem agitação por 1 minuto, e o CQ, o padrão e a solução de tratamento devem ser completamente misturados, seguindo rigorosamente as instruções.

(1) Contaminação do reagente principal;

(2) Falha do reagente principal (caso de falha incompleta), que pode ser causada por temperatura de congelamento insuficiente.

(3) Após a adição do reagente principal, a placa não é colocada no leitor de enzimas para teste em tempo hábil; então, o programa deve ser selecionado e a placa deve ser retirada antes da adição do reagente principal, para que o teste possa ser realizado o mais rápido possível;

(4) Após a adição do reagente principal, a placa é colocada no zimógrafo, mas ele não pode ser iniciado imediatamente porque a temperatura do zimógrafo não foi elevada à temperatura necessária; então, a temperatura deve ser verificada antecipadamente para ver se atende aos requisitos e, se não atender, deve-se elevar a temperatura definida, ajustar de volta para 37 graus após atingir a temperatura e clicar em iniciar diretamente, em vez de clicar na placa ao iniciar a detecção (ou incubação).

(1) A pipeta não permite aspirar o volume da amostra.

Solução: Calibre regularmente e repita com uma pipeta diferente.

(2) Não é uma ponteira livre de pirogênios.

Solução: Use uma ponteira não pirogênica para refazer o procedimento.

(3) A ponteira não está inserida firmemente ou está vazando, portanto a aspiração e a adição não são permitidas.

Solução: Use uma ponteira original, normal e não pirogênica para refazer a verificação. Preste atenção ao nível de líquido na ponteira para evitar usar a ponteira com problema para adicionar amostras novamente.

(1) Verificar se a amostra apresenta problema de hemólise, icterícia ou lipemia.

(2) Mais uma vez, é necessário observar se a linearidade do lote de testes e o valor medido do produto de controle de qualidade atendem aos requisitos do kit e se o valor médio da razão correspondente ao valor da concentração de cada padrão na preparação da curva padrão é de 1,5 a 2 vezes a relação entre a, b, c, d e e.

(3) Se o usuário realiza controle de qualidade interno, também é necessário verificar se os resultados do controle de qualidade do dia estão fora de controle. Se estiverem fora de controle, resolver de acordo com os procedimentos de tratamento de resultados fora de controle.

(4) Primeiro, descartar a existência de fatores que causam falsos positivos ou falsos negativos.

(5) Compreender o contexto clínico da coleta da amostra do paciente, como a duração da doença e se há uso de terapia com medicamentos antifúngicos.

(6) Verificar se a temperatura do instrumento, a precisão da adição da amostra e a homogeneização dos padrões são suficientemente homogêneas.

(7) Contatar a equipe técnica do fabricante para verificar se o problema é causado pelo kit de reagentes.

(1) Escolha um bom produto e faça a verificação de desempenho ou comparação antes do uso;

(2) Opere em estrita conformidade com os procedimentos operacionais (POP) especificados nas instruções;

(3) Siga rigorosamente as instruções para garantir que o teste atenda aos padrões de qualidade;

(4) Estabeleça um sistema de controle de qualidade interno e realize comparação interlaboratorial quando disponível;

(5) Excluindo fatores claros de falso-positivo e falso-negativo.

(6) Utilizando tubos de coleta de sangue a vácuo validados e qualificados pelos fabricantes para garantir amostras qualificadas.

(7) Testagem seriada, com positividade seriada altamente sugestiva de infecção fúngica;

(8) O aparecimento ou desaparecimento de G não pode ser usado como indicação para iniciar ou interromper o uso de medicamentos antifúngicos.

(9) Deve ser analisado em combinação com testes clínicos, de cultura, patológicos e outros testes sorológicos, como teste de GM e teste de MN;

(10) Comunicação estreita com o serviço clínico.

(1) Leitor de microplacas (marcador enzimático): deve ser capaz de utilizar o comprimento de onda de 450nm para deteção (de preferência com duplo comprimento de onda, 450nm e 620nm ou 630nm).

(2) Centrífuga de alta velocidade: deve conseguir atingir uma força centrífuga de 10.000g ou superior, de preferência a 4°C.

(3) Incubadora de temperatura constante a 37℃ (ou outro banho de ar de temperatura constante alternativo): deve permitir definir a temperatura para 37℃.

(4) Equipamento de ebulição: recomenda-se a utilização do banho metálico ou forno de indução verificado e qualificado pela empresa.

(5) Agitador tipo vórtex.

(6) Pipeta multicanal de 300μL (pistola de fileiras) e pontas correspondentes: permite reduzir a diferença de tempo de adição de amostras em diferentes poços.

(7) Pipetas monocanal de 100μL e 1000μL e pontas correspondentes.

(8) Proveta para preparação da solução de lavagem e frasco de reagente para conservação da solução de lavagem.

(9) Filme de selagem de placas: os utilizadores devem preparar uma quantidade sobresselente de acordo com o número de ensaios realizados por cada caixa de reagentes.

(10) Tubo de centrífuga: 1,5ml.

A maioria dos concentrados de lavagem utilizados no teste imunoenzimático é tampão fosfato, mas devido aos diferentes valores de concentração entre os reagentes, é estritamente proibido misturar os reagentes de diferentes fabricantes ou projetos. No entanto, o Concentrado de Lavagem de Antígeno e Anticorpo Dynamiker's pode ser usado para mistura.

Devido à dificuldade da coleta de sangue pediátrica, quando a amostra de soro é insuficiente no pré-tratamento, o processamento pode ser realizado com 180 μL de soro + 60 μL de solução de tratamento. Caso o soro seja suficiente, deve-se processar rigorosamente com 300 μL de soro + 100 μL de solução de tratamento.

(1) A utilização de flutuadores facilmente deformáveis, como espuma, deforma os flutuadores no banho-maria, resultando em pré-tratamento inadequado. A amostra deve ser tratada em banho-maria em ebulição completa;

(2) O sobrenadante não foi aspirado imediatamente após o tratamento, fazendo com que o sobrenadante fosse absorvido pelo precipitado. O sobrenadante deve ser aspirado prontamente;

(3) Algumas centrífugas exibem 10.000 g, mas a força centrífuga real pode não atingir 10.000. O tempo de centrifugação deve ser prolongado ou a força centrífuga deve ser aumentada;

(4) Ao processar amostras individuais, pode haver adesão e delaminação na parede, e a quantidade de sobrenadante pode satisfazer o teste, portanto, deve-se ter cuidado ao aspirar as amostras para evitar aspirar o precipitado. Aumentar o tempo de centrifugação pode resolver esse problema e também aumentar o sobrenadante da amostra. Pode também esmagar o precipitado com a ponta de uma ponteira e centrifugar novamente para obter uma quantidade suficiente de sobrenadante.

(1) Adição imprecisa de líquido: certifique-se de que a quantidade de líquido adicionada seja precisa;

(2) No processo de lavagem da placa, a operação de descarte do líquido da placa não é padronizada, causando contaminação pelo impacto; corrija a operação;

(3) A placa de marcação enzimática é deixada à temperatura ambiente por um longo período, o que leva à falha; tente reduzir o tempo de permanência à temperatura ambiente;

(4) Após a adição do anticorpo primário ou da solução de parada, o tempo de agitação da placa é muito curto ou não há agitação, não ocorrendo mistura completa; o tempo deve ser adequadamente prolongado;

(5) Ao adicionar amostras, pegar o frasco de reagente errado e adicionar o reagente incorreto; o rótulo do reagente deve ser verificado cuidadosamente;

(6) O tempo de incubação não é cumprido conforme o exigido;

(7) Líquido derramado durante a operação, alteração óbvia no volume ou contaminação entre os poços;

(8) A operação de lavagem da placa não é seca com batidas em papel absorvente, havendo resíduo de líquido nos poços.

A literatura estrangeira relata detecção em média 5 a 8 dias antes dos sintomas clínicos de aspergilose invasiva (IA), em média 7,2 dias antes das tomografias computadorizadas de alta resolução e em média 12,5 dias antes do início da terapia antifúngica empírica.

A explicação para este fenômeno é que os neutrófilos são capazes de fagocitar e matar rapidamente o micélio, o que reduz a carga fúngica no organismo e, consequentemente, diminui a quantidade de GM liberada na corrente sanguínea; além disso, há receptores de manose na superfície dos granulócitos, que podem se ligar à GM, e ambos os fatores levam a um resultado falso-negativo no teste de GM.

Todos os estudos demonstraram que o teste de GM apresenta alta especificidade, enquanto a sensibilidade varia (29%-100%). Mennink-Kersten et al. sugerem [25] que existem várias razões para isso.

(1) O crescimento de Aspergillus e a liberação de antígenos estão relacionados às condições nutricionais e ao pH do ambiente circundante. Se a nutrição for adequada e o pH estiver em 7,5, o fungo consegue manter o crescimento e liberar GM, mas, quando se desenvolve inflamação, o crescimento fúngico é inibido e a liberação de GM diminui.

(2) Relaciona-se à exposição a determinantes antigênicos associados a anticorpos monoclonais: se o anticorpo monoclonal EB-A2 reconhece e se liga aos determinantes antigênicos de superfície é um fator importante que afeta a sensibilidade do método. O teste de ELISA do lavado broncoalveolar de um paciente com infecção confirmada por Aspergillus apresentou resultado positivo. No entanto, os testes seriados de antígenos séricos resultaram negativos. Os pesquisadores concluíram que o antígeno furanogalactana estava definitivamente presente no sangue e não foi detectado porque o antígeno GM se liga a algo no sangue que obscurece os determinantes antigênicos que se ligam ao anticorpo monoclonal EB-A2.

(3) Tratamento antifúngico do hospedeiro: se o tratamento antifúngico é realizado ou não antes do teste é um fator importante relacionado à sensibilidade do experimento. Marr et al. [26] analisaram 986 soros de 67 pacientes e verificaram que a sensibilidade do método ELISA em pacientes que não receberam tratamento antifúngico podia atingir 80%, enquanto a sensibilidade em pacientes que haviam recebido tratamento antifúngico era de apenas 20%. Portanto, o artigo 10 das diretrizes da IDSA de 2016 para o diagnóstico e tratamento da aspergilose [27] sugere que o rastreamento rotineiro de sangue para GM não é recomendado em pacientes em uso de terapia antifúngica ou profilaxia, mas amostras broncoscópicas desses pacientes podem ser testadas para GM (altamente recomendado; alto nível de evidência).

Sim, após incubar fora do dispositivo à temperatura ambiente por 20 minutos, toque o teste rápido, leia o resultado em cerca de 10 segundos, e você pode testar vários consecutivamente.

Apenas um teste pode ser colocado no teste padrão de cada vez, portanto, é mais recomendado incubá-lo fora do dispositivo e fazer o teste rápido, pois o teste padrão é facilmente contaminado.

Se optar pela centrifugação aquecida, precisará de tubos EP, centrífugas, banhos-maria ou banhos metálicos e outros consumíveis.

Haverá alguma influência, portanto, é necessário garantir o controle de temperatura e umidade no laboratório para assegurar a precisão dos resultados. A sensibilidade do teste não pode ser garantida quando a temperatura ambiente estiver abaixo de 10℃ ou acima de 40℃ e a umidade relativa for superior a 80%.

1. Pré-tratamento: pré-tratamento insuficiente

2. Tempo de incubação: um tempo de incubação muito longo resultará no enfraquecimento do sinal de fluorescência do grupo ligado, levando a dados baixos na leitura e, consequentemente, a falsos negativos.

3. Temperatura de incubação: a temperatura de incubação afetará a eficiência de ligação.

4. Volume de fortificação excessivo pode levar ao refluxo da amostra, resultando em resultados anormais, como falsos positivos.

Pode haver dois motivos. Um é que o teste G geralmente precede o teste GM positivo, podendo haver uma janela de tempo para a detecção; o outro é que a concentração de GM no organismo está elevada por um curto período de tempo, sendo parte dela transitória, podendo haver um momento de detecção perdido ou o GM estar em um valor baixo (abaixo do limite de detecção do reagente). Portanto, recomenda-se realizar testes dinâmicos em grupos de alto risco, duas vezes por semana, a fim de aumentar a taxa de detecção positiva.

Pesquisas básicas demonstraram que o Aspergillus invade principalmente a parede do vaso sanguíneo, ao longo da parede do vaso, e basicamente não existe no sangue, portanto a hemocultura é negativa. O aparecimento de resultados positivos é causado por contaminação. No entanto, especialistas também têm opiniões diferentes sobre esse ponto de vista, pois alguns laboratórios realmente cultivam Aspergillus do sangue de pacientes com AI. Portanto, acredito pessoalmente que a chave para uma hemocultura positiva para Aspergillus deve ser combinada com o contexto clínico, e então determinar se o resultado é contaminação ou se tem significado.

A Tabela 4 compara as espécies fúngicas detectadas pelo teste G e pelo teste GM, respectivamente. O teste G apresenta resultados positivos para todas as doenças fúngicas, exceto criptococo e saprófitas (incluindo Trichoderma, Rhizoctonia, etc.), enquanto o teste GM é para Aspergillus. No entanto, o Penicillium pode apresentar reação cruzada com os anticorpos GM, resultando em um falso-positivo no teste GM, e a situação é semelhante para alguns criptococos.

Se o teste G for positivo e o teste GM for negativo, é possível que

(1) Infecções fúngicas diferentes de Aspergillus, como Candida.

(2) A presença de um fator que provoque um falso-positivo no teste G em um paciente sem infecção fúngica.

Se o teste G for negativo e o teste GM for positivo, é possível que

(1) Pacientes com deficiência granulomatosa, pacientes com disfunção fagocítica dos granulócitos, sejam incapazes de liberar 1,3-β-D-glucano do fungo.

(2) No estágio inicial da infecção, o crescimento e a secreção de Aspergillus são mais intensos do que a morte, digestão e clivagem de Aspergillus, e a substância 1,3-β-D-glucano detectada pelo teste G não atinge o nível positivo.

A IFD é frequentemente associada ao uso prolongado de antibióticos de amplo espectro; portanto, a IFD e infecções bacterianas graves frequentemente coexistem. Se o teste G ou o teste GM é um verdadeiro positivo (ou seja, o paciente realmente tem uma IFD concomitante) ou um falso positivo (o paciente tem apenas uma infecção bacteriana, e não uma IFD) depende de uma análise clínica abrangente. Por exemplo, o paciente apresenta deficiência de granulócitos? O uso de antibióticos de amplo espectro falhou? Há uma nova lesão na TC de alta resolução do tórax sobreposta à lesão original? As lesões apresentam características de pneumonia varicocélica (ex.: sinal do halo, sinal do crescente aéreo, cavitação, etc.)? As culturas de sangue e de outros sítios estéreis são positivas para fungos, ou o exame microscópico direto revela achados de fungos filamentosos?

Em suma, a avaliação clínica é o juiz final dos resultados do teste G e do teste GM, e os demais exames laboratoriais para fungos (microscopia, cultura, tecnologia de PCR) também apresentam valor de referência muito importante.

(1) Se o teste G for positivo e o teste Mn for negativo:

a. O teste G é um teste pan-fúngico, que pode detectar infecções fúngicas invasivas diferentes de Cryptococcus e Trichoderma; se houver G positivo e Mn negativo, pode ser outras infecções fúngicas, como Aspergillus fumigatus.

b. Mn (manana de Candida) é um componente estrutural da parede celular de Candida, mas seu antígeno é termicamente instável e facilmente degradado.

(2) Teste G negativo e teste Mn positivo:

a. Diferenças no tempo de liberação e na quantidade de liberação dos marcadores:

Em primeiro lugar, esse fenômeno de discordância pode estar relacionado ao tempo de liberação e à quantidade de liberação dos diversos marcadores do teste. Por exemplo, o (1-3)-β-D-glucano não está distribuído na superfície do fungo, e o glucano só pode ser liberado por fagocitose e processamento pelos fagócitos;

b. Presença de fatores interferentes que afetam o teste:

Isso pode ser um falso negativo no teste G ou um falso positivo no teste Mn. Por exemplo, tomar o medicamento antiviral aciclovir pode causar um teste Mn falso positivo e um teste G negativo.